中国矫形外科杂志

2007, No.176(06) 455-458

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TGF-β3真核表达载体转染骨髓基质干细胞促进其向软骨分化的实验研究
Effect of TGF-β3 gene transfer on chondrogenesis of marrow stromal stem cells

郑东;杨述华;袁晓梅;李进;冯勇;徐亮;梅荣成;

摘要(Abstract):

[目的]构建生长转化因子(TGF-β3)含绿色加强绿色荧光蛋白的真核表达质粒pIRES2-EGFP-TGF-β3,然后用该质粒转染骨髓基质干细胞(Marrow stromal cells,MSCs)并促进MSCs向软骨方向分化。[方法]用RT-PCR法从大鼠的胚胎组织中提取TGF-β3的DNA全长,首先连接到pMDl8-T载体,扩增、纯化后经测序公司测序确定插入目的基因序列的正确性,然后再用带有EcoRI、PstI内切酶的引物,从pMD18-T将TGF-β3的全长再次扩增出来,最后将带有酶切位点的TGF-β3的全长插入到真核质粒pIRES2-EGFP中,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-TGF-β3。体外培养大鼠MSCs,应用阳性脂质体将pIRES2-EGFP-TGF-β3转染到MSCs中,24h后在荧光显微镜下观察蛋白的表达,流式检测MSCs的转染效率;Westen Blot检测TGF-β3蛋白的表达;之后进行MSCs细胞球团培养,分别于第7、14、21、28d检测软骨基质胶原Ⅱ,胶原X和Aggrecan的表达,同时用甲苯胺蓝检测蛋白聚糖(proteoglycan)的表达。[结果]测序结果和酶切鉴定结果表明成功的构建了pIRES2-EGFP-TGF-β3质粒,转染MSCs之后,转染的效率达30%。Westen Blot结果表明TGF-β3获得了成功的表达,在接下来的细胞球团培养过程中,转染后MSCs被成功诱导向软骨分化。

关键词(KeyWords): 转化生长因子β3克隆;软骨分化;软骨组织工程;软骨修复;真核细胞;骨髓基质干细胞

Abstract:

Keywords:

基金项目(Foundation): 国家自然基金资助项目(基金编号:30471753)

作者(Author): 郑东;杨述华;袁晓梅;李进;冯勇;徐亮;梅荣成;

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